Utilisation des ultrasons non invasifs pour surmonter la résistance bactérienne aux antibiotiques : application aux mécanismes d’efflux, d’influx et des biofilms

Les ultrasons focalisés de forte intensité (HIFU) sont aujourd’hui utilisés en clinique pour des traitements basés sur l’ablation thermique ou mécanique, notamment contre les cancers et certaines pathologies neurologiques. En parallèle, les ultrasons pulsés de faible intensité (LIPUS), encore à l’étude, émergent comme une approche thérapeutique prometteuse dans divers domaines, tels que la médecine régénérative, la neuromodulation et la délivrance de médicaments. Bien que les LIPUS puissent induire divers effets biologiques selon le type cellulaire et la structure du tissu ciblés, les mécanismes sous-jacents restent mal compris en raison de la complexité des interactions, de la variabilité des protocoles et d’études mécanistiques limitées. Les mécanismes proposés, incluant l’activation des protéines mécanosensibles et la sonoporation, n’expliquent pas tous les effets observés, comme par exemple la potentialisation des effets bactéricides des antibiotiques en absence de cavitation. Nous proposons un nouveau mécanisme selon lequel les LIPUS moduleraient directement l’activité des protéines membranaires en induisant des changements de leur conformation potentiellement réversibles.

Pour tester cette hypothèse encore indémontrée, nous avons étudié deux systèmes bactériens impliqués dans la résistance aux antibiotiques chez Escherichia coli : le système d’efflux AcrA-AcrB-TolC et les porines OmpF/OmpC impliquées dans l’influx. Nos résultats in vivo montrent que l’application des LIPUS focalisés réduit significative la survie bactérienne en présence de moxifloxacine, due à une inhibition de la pompe d’efflux AcrA-AcrB-TolC. Les contrôles effectués en utilisant des mutants de délétion et des analyses par RT-qPCR indiquent que cette inhibition ne serait pas due à une sonoporation, à un effet thermique, à d’autres systèmes d’efflux ou à une régulation transcriptionnelle. De plus, la reconstitution in vitro de AcrB dans des protéoliposomes suggère que cette inactivation résulte d’un effet direct sur le complexe AcrA-AcrB-TolC.
Avant toute application des LIPUS, nous avons exploré le rôle fonctionnel de la boucle L3 des porines OmpF et OmpC, en utilisant des mutants de délétion et de substitution ponctuelle. Nos résultats démontrent que cette boucle joue un rôle important dans le contrôle du passage des antibiotiques, à la fois par son encombrement stérique et et par l’effet de ses charges négatives. Nous émettons l’hypothèse que cette boucle pourrait être une cible potentielle de modulation par les LIPUS.
Enfin, nous avons étudié l’utilisation des LIPUS contre les biofilms bactériens, un facteur clé de la résistance aux antibiotiques. Un modèle de biofilm artificiel basé sur un gel d’alginate montre que les antibiotiques chargés positivement sont piégés par ce gel, contrairement à ceux chargés négativement. L’application des LIPUS favorise la libération contrôlée de la lévofloxacine, qu’elle soit piégée dans le biofilm ou encapsulée dans des nano-gouttelettes, et potentialise son action bactéricide sur E. coli en réduisant significativement sa survie sur une courte durée d’exposition.

Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans l’application des ultrasons comme adjuvant au traitement par les antibiotiques, offrant une approche innovante pour améliorer l’efficacité des antimicrobiens.

Use of non-invasive ultrasound to overcome bacterial resistance to antibiotics: application to efflux, influx and biofilm mechanisms

High-intensity focused ultrasound (HIFU) is currently used in clinical settings for treatments based on thermal or mechanical ablation, particularly against cancer and certain neurological disorders. In parallel, low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS), still under investigation, is emerging as a promising therapeutic approach in various fields, such as regenerative medicine, neuromodulation, and drug delivery. Although LIPUS can induce various biological effects depending on the cell type and the structure of the targeted tissue, the underlying mechanisms remain poorly understood due to the complexity of interactions, variability in protocols, and limited mechanistic studies. Proposed mechanisms include the activation of mechanosensitive proteins and sonoporation, but these do not fully explain all observed effects, such as the potentiation of the bactericidal effects of antibiotics in bacteria in the absence of cavitation. We propose a novel mechanism by which LIPUS directly modulates the activity of membrane proteins by inducing a reversible conformational change.

To test this yet unproven hypothesis, we studied two bacterial systems involved in antibiotic resistance in Escherichia coli: the AcrA-AcrB-TolC efflux system and the OmpF/OmpC porins involved in influx. Our in vivo results show that LIPUS application significantly reduces bacterial survival in the presence of moxifloxacin due to the inhibition of the AcrA-AcrB-TolC efflux pump. Various controls performed indicate that this inhibition is not due to sonoporation, thermal effects, or the involvement of other efflux systems. Furthermore, RT-qPCR analyses reveal that this effect results from a direct interaction with the pump and not from transcriptional regulation. Additionally, reconstitution of AcrB in proteoliposomes suggests that this inactivation results from an effect on the entire AcrAB-TolC complex. Finally, these in vitro results indicate that focused LIPUS potentiates AcrB transport activity at specific acoustic parameters. These findings are particularly interesting since no clinical inhibitors of these efflux systems are currently available.
Additionally, we explored the functional role of the L3 loop of OmpF and OmpC porins using deletion and point substitution mutants. Our experiments demonstrate that this loop plays a crucial role in antibiotic entry, primarily through steric hindrance and secondarily through the effect of its negative charges. We hypothesize that this structure could be a potential target for modulation by LIPUS, a hypothesis to be explored in future studies.
Finally, we investigated the use of LIPUS against bacterial biofilms, a key factor in antibiotic resistance. A biofilm model based on an alginate gel was used to study antibiotic entrapment. Our results show that positively charged antibiotics are trapped by the alginate gel, whereas negatively charged ones are not. LIPUS application promotes the release of levofloxacin, whether trapped in the biofilm or encapsulated in nanodroplets, and enhances its bactericidal action against E. coli by significantly reducing bacterial survival over a short exposure time.

These findings open new perspectives on the use of LIPUS as an adjuvant treatment to antibiotics, offering an innovative approach to combating bacterial resistance and improving the effectiveness of antimicrobial treatments.