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Type de stage

Masters M1 et/ou M2

Dates / durée

Date limite de candidature 15 janvier 2027

Période de stage flexible : entre janvier et juillet 2027

Contexte

L’alginate est l’exopolysaccharide qui confère aux biofilms de Pseudomonas aeruginosa une grande part de leur tolérance aux antibiotiques. Dans un modèle artificiel de gel de calcium-alginate colonisé par Escherichia coli, les travaux de thèse de Luc Hennion au LIB ont établi que ce polyanion séquestre les antibiotiques chargés positivement et laisse passer les autres [1]. La lévofloxacine dont une part des micro-espèces est cationique à pH 6, est partiellement retenue. Des ultrasons pulsés non focalisés de faible puissance (1 MHz ; 0,28 MPa ; rapport cyclique 10 % ; 30 min ; sans cavitation) libèrent la fraction piégée. La survie bactérienne est divisée par 7 et 21 selon la concentration, et par 63 lorsque l’antibiotique est encapsulé dans des nano-gouttelettes sono-sensibles. Les ultrasons seuls et les nano-gouttelettes vides sont sans effet.

Ce gel artificiel est volontairement simplifié : homogène, uniformément anionique et dépourvu de cellules, il permet d’étudier une seule variable, la charge électrique de l’antibiotique. Un biofilm naturel est beaucoup plus complexe. Sa matrice associe des polysaccharides, de l’ADN extracellulaire (lui aussi polyanionique) et des protéines, et elle abrite des bactéries vivantes organisées en micro-colonies séparées par des canaux aqueux (Figure 1). Chez P. aeruginosa par exemple, la tobramycine reste piégée à la périphérie du biofilm alors que la ciprofloxacine en atteint le cœur [2]. Il reste donc à savoir si la règle observée dans l’alginate (les antibiotiques cationiques sont retenus, les autres passent librement) s’applique encore dans une matrice du biofilm naturel, et si les ultrasons y conservent leur effet. Pour répondre à cette question, nous proposons de travailler avec Pseudomonas fluorescens. Cette espèce non pathogène, manipulable en laboratoire L1, est proche de P. aeruginosa et capable elle aussi de produire de l’alginate [3]. Elle nous permet de passer à un biofilm vivant sans changer de genre bactérien.

Objectif

L’objectif du stage est de vérifier si la charge d’un antibiotique gouverne encore son passage lorsque l’on remplace le gel d’alginate par un biofilm naturel. Si c’est le cas, les trois antibiotiques testés devraient se ranger dans le même ordre que celui prédit par l’alginate : une β-lactamine anionique qui n’est pas retenue devrait agir pleinement ; la lévofloxacine en partie cationique devrait être partiellement freinée ; la tobramycine fortement cationique devrait être la plus retenue. Le bénéfice des ultrasons devrait alors être d’autant plus important que l’antibiotique est retenu. Si cet ordre n’est pas respecté, cela voudra dire que d’autres propriétés du biofilm naturel (ADN extracellulaire, structure hétérogène, présence des cellules elles-mêmes) prennent le pas sur la charge. Dans les deux cas, le résultat nous dira jusqu’à quel point le modèle d’alginate permet de prédire ce qui se passe dans un vrai biofilm.

Mission(s)

Le stage de M2 s’organisera autour de trois questions, abordées dans l’ordre suivant :

1. Peut-on obtenir un biofilm reproductible dans notre montage ? Le biofilm de P. fluorescens sera cultivé pendant 48 h à 28 °C sur une membrane [4], puis déposé sur le disque en Teflon, à la place du gel d’alginate colonisé par E. coli utilisé pendant la thèse (Figure 2A). Il s’agira d’abord de vérifier par dénombrement des UFC que le nombre de bactéries est reproductible d’un biofilm à l’autre et que les ultrasons appliqués seuls ne le modifient pas.
2. La charge de l’antibiotique détermine-t-elle toujours son efficacité ? Trois antibiotiques de charges électriques différentes seront testés séparément en les déposant sous le biofilm : une β-lactamine anionique, la lévofloxacine et la tobramycine. Chacun sera utilisé au même multiple de sa CMI, préalablement mesurée sur P. fluorescens. La survie des bactéries du biofilm sera ensuite mesurée par dénombrement des UFC, avec ou sans ultrasons, dans les conditions établies pendant la thèse de Luc Hénion. Si notre hypothèse est juste, la tobramycine devrait être la moins efficace sans ultrasons, et c’est elle qui devrait bénéficier le plus de leur application (Figure 2B).
3. L’effet dépend-il de la concentration ? Dans l’alginate, le piégeage des antibiotiques est saturable et le gain apporté par les ultrasons varie avec la concentration [1]. Nous répéterons donc l’expérience à deux concentrations, 1 × CMI et 2 × CMI, pour voir si le biofilm naturel se comporte de la même façon.

Les témoins seront simples : ultrasons seuls, antibiotique seul, et une température identique dans toutes les conditions. Le bain sera maintenu à 28 °C car P. fluorescens se développe mal à 37 °C. Quel que soit le résultat, il sera utile. Si l’on retrouve dans le biofilm naturel ce que nous avons observé dans l’alginate, ce gel deviendra un modèle prédictif validé, et la charge pourra servir de critère pour choisir l’antibiotique à associer aux ultrasons. Dans le cas contraire, nous aurons identifié ce que le biofilm naturel ajoute à la simple barrière de charge, ce qui nous orientera vers des approches combinées comme les nano-gouttelettes sono-sensibles [5]. Ce travail prépare enfin le passage à P. aeruginosa et à d’autres bactéries pathogènes à Gram positif, qui sont les cibles cliniques de notre programme.

Références bibliographiques

[1] Hennion L. (2025). Utilisation des ultrasons non invasifs pour surmonter la résistance bactérienne aux antibiotiques : application aux mécanismes d’efflux, d’influx et des biofilms. Thèse, Sorbonne Université, chap. 3.3 et § 4.4.
[2] Tseng B. S., Zhang W., Harrison J. J., Quach T. P., Song J. L., Penterman J., Singh P. K., Chopp D. L., Packman A. I., Parsek M. R. (2013). The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ. Microbiol. 15(10), 2865–2878. doi:10.1111/1462-2920.12155.
[3] Hay I. D., Wang Y., Moradali M. F., Rehman Z. U., Rehm B. H. A. (2014). Genetics and regulation of bacterial alginate production. Environ. Microbiol. 16(10), 2997–3011. doi:10.1111/1462-2920.12389.
[4] Anderl J. N., Franklin M. J., Stewart P. S. (2000). Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob. Agents Chemother. 44(7), 1818–1824. doi:10.1128/AAC.44.7.1818-1824.2000.
[5] Choi V., Carugo D., Stride E. (2025). Repurposing antimicrobials with ultrasound-triggered nanoscale systems for targeted biofilm drug delivery. npj Antimicrob. Resist. 3, 22. doi:10.1038/s44259-025-00086-3.

 

Compétences

• Formation de niveau Master M1 ou M2 en biologie, biophysique ou domaine équivalent.
• Expérience pratique : mise en place de protocoles, mesures et acquisition des données.
• Bonne connaissance de l’anglais scientifique (lecture et rédaction).
• Connaissances en acoustique (appréciées mais non obligatoire).

Rémunération

Gratifications de stage

Contact

• Houssain Benabdelhak maître de conférences en Biochimie-Microbiologie à Sorbonne Université houssain.benabdelhak[at]sorbonne-universite.fr
• Nicolas Taulier, DR2-CNRS Biophysicien nicolas.taulier[at]sorbonne-universite.fr
• Déhélia Chettouf, doctorante en 3ème année de thèse en biophysique au LIB dehelia.chettouf[at]sorbonne-universite.fr