Type de stage
Masters M1 et/ou M2
Dates / durée
Date limite de candidature 15 janvier 2027
Période de stage flexible : entre janvier et juillet 2027
Contexte
Chez Escherichia coli, la pompe tripartite AcrA–AcrB–TolC expulse une large gamme d’antibiotiques et constitue un déterminant majeur de la résistance intrinsèque. AcrB, homotrimère de la famille RND, en est le moteur : chacun de ses protomères parcourt un cycle de trois états conformationnels (accès, fixation, extrusion) qui couple la fixation du substrat antibiotique dans une poche distale riche en phénylalanines au passage de protons le long de la force proton-motrice [1, 2] (Figure 1). Les travaux de thèse de Luc Hennion dans notre équipe ont révélé deux réponses opposées aux ultrasons pulsés de faible intensité (LIPUS) [3]. In vivo (1,1 MHz ; 1,25 MPa pression négative ; rapport cyclique 10 %), la survie d’E. coli en présence de moxifloxacine diminue d’un facteur 1,7 chez la souche sauvage, mais pas chez les mutants ΔacrB et ΔtolC. L’efflux est partiellement inhibé, sans sonoporation (sans perméabilisation de la membrane), sans effet thermique et sans modification transcriptionnelle des protéines impliquées. In vitro (0,5 MPa ; rapport cyclique 5 %), AcrB seule reconstituée en protéoliposomes est au contraire activée. Le transport de nitrocéfine sous LIPUS augmente de 68% à 37°C et de 47% à 27°C, et disparaît sans gradient de protons. Ces réponses ne sont pas contradictoires car selon qu’AcrB est isolée ou en complexe tripartite, elle se trouvent dans deux environnements distincts et des paramètres acoustiques différents. Mais dans les deux cas, la tache focale des LIPUS ne couvre que quelques mm³ d’un échantillon d’environ 100 mm³, si bien que la mesure globale sous-estime fortement la modulation réelle.
Figure 1. La pompe d’efflux AcrA–AcrB–TolC et le cycle conformationnel d’AcrB. A. Organisation tripartite dans l’enveloppe d’E. coli souche B. Chaque protomère parcourt le cycle « accès → fixation → extrusion » entraîné par la force proton-motrice ; la poche distale (F178, I277, V612, F615) fixe la plupart des substrats. Non à l’échelle [1, 2].
Objectif
La question posée pour le stage est mécanistique : comment une onde mécanique non destructive modifie-t-elle l’activité d’un transporteur qui n’est pas mécano-sensible ? Les ultrasons déplacent l’équilibre entre des états conformationnels d’AcrB, et modifient ainsi l’affinité apparente et l’accessibilité de sa poche distale. Deux prédictions en découlent : (i) la fixation d’un substrat dans cette poche doit varier sous ultrasons ; (ii) cette variation doit s’atténuer lorsque le cycle catalytique est bloqué. Pour les tester, nous suivrons la fixation de la fluorescéine-5-maléimide, substrat d’AcrB reconnu par la poche distale, sur une cystéine unique introduite dans cette poche par mutation. La sonde s’y fixe de façon covalente ce qui fige et rend quantifiable un événement de reconnaissance transitoire [4]. Ce serait à notre connaissance, la première démonstration d’une modulation conformationnelle par ultrasons d’une protéine membranaire dite non-mécano-sensible [5].
Mission(s)
Le stagiaire du master M2 sera chargé de remplacer les deux cystéines natives d’AcrB par des sérines (C493S/C887S) pour obtenir le fond « cystéine-less » (CL) de Takatsuka et al. [4]. La phénylalanine 615 de la poche distale est ensuite mutée en cystéine. Le mutant CL-F615C ne porte donc qu’une cystéine par monomère dans la poche étudiée. Après purification et contrôle de son activité de transport, AcrB CL-F615C est reconstitué en protéoliposomes DOPC/cholestérol d’environ 200 nm sans β-lactamase et avec un gradient de pH imposé (intérieur 7,3 ; extérieur 8). L’élimination du détergent produit des orientations mixtes : seules les molécules dont le domaine périplasmique est exposé au milieu extérieur sont accessibles à la sonde (Figure 2A). Les échantillons sont incubés 30 min avec la sonde, avec ou sans ultrasons, dans les conditions LIPUS ayant activé AcrB. La réaction est arrêtée dès la fin de l’exposition par ajout du tampon de charge, puis les échantillons sont déposés sur gel SDS-PAGE, la sonde libre étant séparée pendant la migration. La fluorescence de la bande d’AcrB sur gel est rapportée à la quantité de protéine déposée (Figure 2B).
Figure 2. Marquage covalent de la poche distale d’AcrB en protéoliposome. A. La sonde est ajoutée à l’extérieur (pH 8), l’intérieur étant à pH 7,3 ; seules les molécules d’AcrB dont le domaine périplasmique est tourné vers l’extérieur exposent Cys615. B. Lecture par SDS-PAGE ; les niveaux figurés sont une attente, non un résultat.
Quatre témoins tous comparés avec et sans ultrasons encadrent la mesure. AcrB CL dépourvue de cystéine établit le bruit de fond. L’abolition du gradient de pH et le variant CL-F615C-D407N, incapable du couplage proton–substrat, testent le lien entre fixation et fonctionnement du transporteur ; un marquage résiduel y reste possible et sera quantifié. Une compétition avec la nitrocéfine ou la minocycline vérifie que le marquage cible bien la poche [4]. La température est suivie en continu et l’absence de cavitation contrôlée.
Références bibliographiques
[1] Zhang Z. et al. (2023). Cryo-EM Structures of the Klebsiella pneumoniae AcrB Multidrug Efflux Pump. mBio 14, e00659-23. doi:10.1128/mbio.00659-23.
[2] Ge X., Gu Z., Wang J. (2026). Structural mechanisms of pump assembly and drug transport in the AcrAB–TolC efflux system. eLife 14, RP109684. doi:10.7554/eLife.109684.
[3] Hennion L. (2025). Utilisation des ultrasons non invasifs pour surmonter la résistance bactérienne aux antibiotiques : application aux mécanismes d’efflux, d’influx et des biofilms. Thèse, Sorbonne Université, pp. 151–172 et 186–189.
[4] Takatsuka Y., Chen C., Nikaido H. (2010). Mechanism of recognition of compounds of diverse structures by the multidrug efflux pump AcrB of Escherichia coli. PNAS 107, 6559–6565. doi:10.1073/pnas.1001460107.
[5] Blanco-González A., Piñeiro Á., García-Fandiño R. (2025). Instability and resilience at the lipid membrane interface under ultrasound: composition matters. Arch. Biochem. Biophys. 771, 110523. doi:10.1016/j.abb.2025.110523.
Compétences
- Formation de niveau Master M1 ou M2 en biologie, biophysique ou domaine équivalent.
- Expérience pratique : mise en place de protocoles, mesures et acquisition des données.
- Bonne connaissance de l’anglais scientifique (lecture et rédaction).
- Connaissances en acoustique (appréciées mais non obligatoire).
Rémunération
Gratifications de stage
Contact
- Houssain Benabdelhak maître de conférences en Biochimie-Microbiologie à Sorbonne Université houssain.benabdelhak[at]sorbonne-universite.fr
- Nicolas Taulier, DR2-CNRS Biophysicien nicolas.taulier[at]sorbonne-universite.fr
- Déhélia Chettouf, doctorante en 3ème année de thèse en biophysique au LIB dehelia.chettouf[at]sorbonne-universite.fr
